Immunohistochimie L’immunohistochimie c’est la combinaison de l’immunologie et de l’histochimie, elle a 2 buts essentiels : Détection spécifique de protéines.

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1 Marquages cellulaires et tissulaires, immunocytologie et immunohistologie

2 immunohistochimie L’immunohistochimie c’est la combinaison de l’immunologie et de l’histochimie, elle a 2 buts essentiels : Détection spécifique de protéines sur matériel cytologique ou sur coupes tissulaires – Localisation (+/- quantification) d'une protéine dans une cellule ou un tissu Système de révélation Coupe tissulaire

3 Les techniques d'immunofluorescence tissulaire ou d'immunohistochimie sont utilisées pour détecter, localiser, voire estimer le niveau d'expression de protéines d'intérêt sur un matériel cytologique ou des coupes tissulaires. Cette technique se décompose en trois étapes principales qui sont (1) la préparation de l'échantillon contenant l'antigène à étudier, (2) l'utilisation d'un anticorps dirigé contre l'antigène recherché et (3) l'apport d'un système révélateur pour visualiser l'immunoréaction.

4 Méthodologie Les tissus sont analysés après fixation chimique, inclusion et coupe en paraffine, ou après congélation et coupe au cryostat. La fixation avec inclusion en paraffine ou la congélation préviennent de toute dégradation secondaire à une prolifération bactérienne ou à l'action des enzymes libérées lors de la mort cellulaire, et confèrent au tissu une rigidité indispensable à sa découpe

5 Préparation de l’échantillon
Fixation Prélèvement Biopsie C’est un fixateur : précipitation, polymérisation, coagulation des protéines ; - formation des liaisons covalentes entre les aa (tyr, Arg); - tue les cellules ; - blocage des réactions enzymatiques. Fixation Biopsie Formol Cassette Incubation 24h

6 Le fixateur chimique le plus utilisé est le formaldéhyde
Le fixateur chimique le plus utilisé est le formaldéhyde. Ce produit réalise des pontages intermoléculaires qui préservent bien la morphologie cellulaire et tissulaire. Cependant, il induit une importante dénaturation des antigènes dont les épitopes peuvent être altérés. L'éthanol et l'acétone sont des fixateurs précipitants qui préservent mieux l'antigénicité des protéines mais qui ont un effet dénaturant sur la morphologie cellulaire et tissulaire L'inclusion d'un tissu dans la paraffine ou dans une résine génère des variations thermiques qui peuvent également être délétères pour certains épitopes.

7 Inclusion Déshydratation Paraffinization
Éliminer le fixateur et éliminer l’eau qui existe dans les cellules. Inclusion Déshydratation Alcool 60% (30min) A2. 70% (30min) A5. 100% (30min) Paraffinization X3 (30min) X2 (15min) Xylène1 (15min) Éliminer l’alcool.

8 La fixation en congélation est obtenue par l'immersion du tissu dans un liquide refroidissant (isopentane à −130 °C) ou directement dans l'azote liquide (snap-freezing, −196 °C) puis son maintien en vapeur d'azote liquide ou au moins à −80 °C. Avant la coupe, le tissu congelé est enrobé dans une substance protectrice (cryoprotecteur OCT) qui se solidifie rapidement au froid et permet de constituer un bloc plus facile à manipuler au cryomicrotome. Le maintien de l'intégrité des antigènes est préservé dans les tissus congelés car les protéines se trouvent dans un état structurel moins dénaturé. Cependant, la préservation de la morphologie du tissu est moins bonne qu'avec un fixateur chimique

9 Paraffinisation Inclusion Paraffine 60°C Congélation 2h

10 Les blocs inclus en paraffine sont découpés avec un microtome en coupes d'une épaisseur de 4 à 5 μm.
Un cryomicrotome (ou cryostat) permet de réaliser des coupes de tissus congelés à une température de −30 à −20° C, d'une épaisseur de 5 à 10 μm. Pour les tissus fixés, un démasquage antigénique est nécessaire pour rompre les liaisons moléculaires créées par le fixateur, modifier la configuration spatiale des épitopes et améliorer leur accessibilité aux anticorps. Ce démasquage peut être enzymatique, avec de la pronase (0,1 % à 37 °C) ou physique par chauffage au micro-ondes ou en autocuiseur en tampon citrate ou EDTA.

11 Réalisation des coupes
ruban Réalisation des coupes Coupe Microtome Instrument permettant de faire des coupes extrêmement fines d'un objet ou d'un tissu organique, préalablement durci, et dont on étudie la structure au microscope. Bloc

12 Déplissement lame silanisée Séchage pendant 24h Eau + alcool Eau tiède

13 Démasquage de l’antigène
98°c 40 mn Solution de démasquage Le démasquage thermique des Ag constitue une avancée considérable pour l'IHC sur coupes de tissus fixés. Les mécanismes de ce démasquage restent encore très mal compris. Par contre les paramètres qui régissent le procédé ont été largement étudiés et permettent d'optimiser de façon raisonnée, la technique de démasquage des Ag par la chaleur. De nombreux phénomènes ont été impliqués dans la fixation au formol, en particulier la formation de ponts entre acides aminés impliquant en particulier des résidus Tyrosine près du site de fixation ou une arginine située ailleurs (5). Certains épitopes ne sont pas affectés par la fixation au formol, d’autres ne le sont que lorsqu’ils sont associés à d’autres protéines non spécifiques Un nombre important d'Ag ne sont pas reconnus par les Ac(modification de la structure de l'épitope liées à la fixation),. Ces difficultés peuvent être contournées en prétraitant les coupes, avant l'application de l'Ac primaire, par une solution de protéase et/ou en les soumettant à un démasquage thermique

14 Avantages Amélioration de l'exposition des épitopes antigéniques sur la surface de la section de tissus. Réduction du temps d'incubation de l'anticorps primaire Cohérence et fiabilité de la coloration. Facilité d'utilisation.

15 Empêche la migration de l’anticorps
DAKO- PEN H2O2 PBS (5min) Eau distillée (5min) Empêche la migration de l’anticorps PBS (5min) Bloquer les peroxydases endogènes en incubant le tissu dans du peroxyde d’hydrogène (H2O2) Mettre les lames dans l’eau oxygénée pour inhiber les enzymes de la membrane (peroxydase endogène) qui sont libérés et font une réaction positive avec l’anticorps

16 Des anticorps monoclonaux ou polyclonaux peuvent être utilisés pour rechercher l'expression de la protéine d'intérêt dans le tissu. Les anticorps monoclonaux sont plus sensibles à la qualité de la fixation en raison de leur spécificité plus étroite. Les anticorps polyclonaux de spécificité plus large ont l'avantage de reconnaître différents épitopes de l'antigène. Leur avidité et leur spécificité sont variables suivant les lots. Pour révéler la fixation de l'anticorps au tissu, une méthode directe ou indirecte peut être employée. La méthode directe utilise directement des anticorps marqués (ou conjugués), appelés anticorps de révélation. Cette technique est simple et rapide, de localisation précise mais de sensibilité médiocre

17 Application des anticorps
Révélation ET Coloration Anticorps primaire Anticorps secondaire DAB : les techniques enzymatiques utilisant la pro­priété de certaines enzymes simples comme la peroxydase de transformer un substrat incolore et soluble en un produit coloré, qui éventuellement précipite, permettant ainsi une visualisation rapide. Plus particulièrement, la présente invention concerne les techniques immunohistochimies mettant en œuvre une réaction immunologique, par exemple les techniques de dosages immunologiques, utilisant un mar­quage enzymatique. 30 min 50 min PBS (5min)

18 La méthode indirecte utilise un anticorps primaire non marqué spécifique de l'antigène, dont sa fixation est révélée par un anticorps secondaire marqué. Cette méthode est privilégiée lorsque le niveau d'expression de l'antigène à analyser est faible. Une amplification supplémentaire du signal initial peut être obtenue par l'utilisation d'un système streptavidine–biotine ou avidine–biotine (e.g. ABC). Il est également possible de réticuler un anticorps tertiaire marqué par la protéine A ou la protéine G.

19 Résultats

20 Résumé du protocole Déparaffinage Démasquage Crayon hydrophobe
Eau oxygéné Anticorps primaire puis AC secondaire Révélation coloration Montage des lames

21 Remarque: Les traceurs fluorescents tels que l'isothiocyanate de fluorescéine (FITC) ou la phycoérythrine (PE) sont surtout utilisés sur coupes congelées. Ils confèrent une grande sensibilité à la technique et permettent des analyses confocales, autorisant l'examen de colocalisations cellulaires. Ils nécessitent un montage en milieu aqueux labile et la lumière émise disparaît au cours du temps

22 Les traceurs enzymatiques, tels que la peroxydase de raifort (HRP) associée pour chromogène à la diaminobenzidine (DAB), donnent une coloration stable brune. La phosphatase alcaline est également utilisée avec le chromogène Fast blue pour une coloration bleue ou avec le Fast red pour une coloration rouge. Ces traceurs permettent une visualisation en microscopie optique. Les marquages sont stables, des doubles marquages peuvent être réalisés sans pour autant permettre de visualiser de colocalisation. La précision du marquage est moyenne en raison d'une diffusion du précipité.

23 Recommandations de mise en œuvre
Il est nécessaire de s'assurer de la spécificité du marquage et de l'absence de bruit de fond. Des marquages non immuns peuvent se produire, secondaires à des interactions ioniques, hydrophiles ou hydrophobes entre l'anticorps et des protéines du tissu ou encore secondaires à une activité biotine endogène du tissu ou une mauvaise inhibition des peroxydases endogènes tissulaires. Des marquages immuns non spécifiques peuvent être la conséquence de réactions croisées.

24 Une étape de mise au point est nécessaire pour déterminer les conditions d'un marquage optimal : conditions de démasquage, concentration des anticorps primaire et secondaire, concentration des chromogènes, temps de révélation. Il faut souligner qu'un anticorps performant en western-blot n'est pas nécessairement adapté à l'immunohistochimie. Les fournisseurs d'anticorps précisent généralement si l'anticorps a été testé sur coupes de tissus congelés ou inclus en paraffine. Des contrôles négatifs et positifs doivent être réalisés. Les contrôles négatifs peuvent être (1)  un immunomarquage sans incubation avec l'anticorps primaire, (2) une incubation avec un anticorps de même isotype à la même concentration que l'anticorps primaire, dirigé contre un antigène absent du tissu, (3) une incubation de l'anticorps sur un tissu ne renfermant pas l'antigène ou (iv) une incubation avec l'anticorps primaire spécifique préalablement saturé par l'antigène purifié. Les contrôles positifs sont réalisés en utilisant des témoins externes et internes

25 L'analyse de l'immunomarquage est le plus souvent qualitative et tente de définir quelles cellules sont positives et quelle est la localisation cellulaire du marquage (membranaire, cytoplasmique ou nucléaire). Une analyse visuelle semi-quantitative peut être réalisée en prenant en compte le comptage des structures ou cellules immunomarquées par unité de surface ou champ microscopique. Des outils spécifiques ont été développés pour permettre une analyse quantitative des immunomarquages. La première étape consiste le plus souvent en une numérisation de l'immunomarquage par un scanner haute résolution. Une analyse quantifiée de l'immunomarquage est ensuite réalisée par un programme d'analyse d'image dédié

26 Immunofluoresence Luminescence Chimiluminescence Electroluminescence
Photoluminescence Thermoluminescence Bioluminescence Fluorescence Phosphorescence

27 Les fluochromes absorbent la lumière d’une certaine longueur d’onde (excitation) et émettent de la lumière d’une autre longueur d’onde (émission). La fluorescence est un phénomène physique caractérisé par l’émission d’une lumière de plus faible énergie que celle absorbée. Émission E’ S1 État excité instable excitation Absorption E Désexcitation S0 État fondamentale stable

28 Les fluorochromes Fluorochromes Rhodamine FITC
utilisé en général pour le double marquage, donne une fluorescence rouge-orangée. dérivé de la fluorescéine (émission = 520 nm, couleur verte). Dans ce cas on recherche sur le même frottis ou la même coupes deux antigènes différents . On utilise alors deux réactifs différents: -un anticorps contre le premier antigène marqué à la fluorescéine. -un anticorps marque à la rhodamine.

29 E E E FITC Rhodamine B luminol
Suivant le colorant utilisé on peut avoir différentes couleurs selon leurs longueur d’onde E E E FITC Rhodamine B luminol

30 Immunofluorescence directe Immunofluorescence indirecte
Les type de l’ immunofluorecence Immunofluorescence directe Immunofluorescence indirecte

31 Microscope à fluorescence
L’ immunofluorecence directe Moins sensible Méthode en un temps , l’Ag est recherché directement par l’Ac spécifique marqué. FITC Premier Ac (sérum) Coupe tissulaire Microscope à fluorescence

32 Deuxième Ac marqué au FITC Microscope à fluorescence
L’ immunofluorecence indirecte Deuxième Ac marqué au FITC FITC Premier Ac (sérum) Coupe tissulaire Microscope à fluorescence

33 Application Auto-immunité : détection des Ac antinucléaire, anti-organites ou Ac spécifiques d’organe. Microbiologie : bactériologie, virologie (cinétique de multiplication de virus, détection de virus responsable d’infection respiratoire)…

34 Radio-immunologie (RIA)
C’est une technique de médecine nucléaire in vitro qui utilise des composés radioactifs associés à des antigènes. Elle sert à doser de manière très précise des substances biologiques Basée sur un phénomène de compétition entre un Ag-marqué par un radio-isotope (C14, I125, H3,S35) et un Ag non marqué que l’on veut doser, cette compétition s’exerce vis-à-vis d’un anticorps spécifique. Deux atomes sont dits isotopes si leur noyau a un nombre de proton identique (z) mais un nombre de neutrons différent (N) donc différence de masse atomique (A). radio-isotope

35 + 4 . séparation après précipitation et élimination du surnageant
Ag à doser Ag marqué par un isotope Autres Ag Ac spécifiques + 4 . séparation après précipitation et élimination du surnageant échantillon à doser + solution de scintillation 2. ajout du marqueur (Ag marqué) 3. ajout de l'anticorps spécifique le comptage par scintillations: consiste à solubiliser l'échantillon dans une solution contenant des molécules pouvant émettre des photons (d'où "scintillations") lorsqu'elles sont excitées par les rayonnements de l'isotope. Ces photons peuvent être détectés quantitativement par une cellule photoélectrique. Détection du signal

36  Dosage avec le sérum du patient.
 Réalisation d’une courbe d’étalonnage avec des solutions d’Ag de concentrations connues Intensité signal  Dosage avec le sérum du patient. Détermination de la concentration d’Ag contenu dans le sérum à l’aide de la courbe étalon. 1 10 100 1000 [Ag] non marqué ng/ml Courbe d’étalonnage

37 Les techniques d'immunomarquage, mettant en corps les anticorps, sont parmi les plus performantes. Leur succés viens à la fois de leur facilité de mise en oeuvre, du nombres de molécules différentes que peuvent reconnaitre les anticorps et du fait que les mêmes anticorps peuvent servir aussi bien à marquer des cellules en vue d'une observation microscopique qu'à des dosages extrèmement précis. Quand on arrive à trouver un anticorps qui reconnait une molécule, le test est quasiment derrière. Ces possibilités et le fait qu'il est possible de produire quasiment n'importe quel anticorps à partir du moment ou l'on dispose de la molécule à reconnaitre ont fait qu'aujourd'hui, la plupart des tests diagnostics, dont celui du VIH dans le sang, sont basés sur les anticorps. Il existe plusieurs techniques d'immunomarquage. L'immunohistofluorescence et l'immunihistochimie correspondent à l'immunomarquage des tissus biologiques, le premier utilisant un fluorophore comme marqueur alors pour le second c'est une enzyme. L'immunocytofluorescence et (beacoup plus rarement) l'immunocytochimie correspondent au marquage de cellules ou d'organites cellulaires. Il exite aussi toutes les variantes utilisant la radioactivité et les métaux lourds pour le microscope électronique.